污泥消化液含有高浓度NH4+-N和大量难降解有机物，是一种典型低COD/N废水。目前污泥消化液常用处理方式是将上清液回流至主流工艺前端与市政污水混合处理，这将会使二级生物处理工艺进水氮负荷提高15%~25%，从而增加污水厂的处理成本和处理难度。

厌氧氨氧化（Anammox）作为一种新型脱氮工艺，与传统工艺相比具有污泥产量少、曝气能耗低、脱氮效率高等优点。以Anammox为核心的自养脱氮工艺已成功应用于污泥消化液的处理，但该工艺仍受限于厌氧氨氧化菌（AnAOB）易流失以及易受进水有机物影响等问题。目前的研究表明，有机物容易对Anammox系统的脱氮性能造成影响。Zhang等研究发现当进水COD为800mg/L（COD/N为4）时，氨氧化细菌（AOB）和AnAOB的活性与生物多样性受到抑制，进而影响短程硝化-厌氧氨氧化（PNA）系统脱氮效果。然而也有研究表明低浓度有机物或低COD/N不会对Anammox系统的污染物去除造成影响。Chen等发现有机物浓度为10~30mg/L（COD/N<1）时，Anammox和反硝化互利共生，平均TN去除效果提高3.2%~7.7%。目前，关于有机物对Anammox系统影响的研究主要集中在成熟的Anammox活性污泥或生物膜系统中，鲜见进水COD对一体式泥膜复合短程硝化-厌氧氨氧化生物膜反应器（PNA-MBBR）挂膜启动的研究。

因此，模拟青岛某污水处理厂污泥消化液水质，探究进水COD（500mg/L，COD/N为1.25）对一体式泥膜复合PNA-MBBR系统挂膜启动过程中脱氮性能以及絮体污泥和生物膜中微生物群落的影响，以期为研发以Anammox为核心的高氨氮、低COD/N废水处理工艺提供理论基础与技术支持。

1、材料与方法

1.1 试验装置

试验在两个有机玻璃制成的SBR反应器中进行。反应器内径为18cm，有效高度为40cm，有效体积为10L；内部填充K3型载体，比表面积为500m2/m3，填充率为30%；反应器配有pH、DO以及温度检测探头，内置电动搅拌器以确保流化效果。

1.2 接种污泥和进水水质

接种污泥取自青岛市某污水处理厂好氧池，反应器MLSS设置为5000mg/L。试验采用模拟废水，NH4+-N为400mg/L，COD为500mg/L（CH3COONa∶C6H12O6=1∶1），KH2PO4为0.1mg/L，由NaHCO3提供碱度和无机碳源，微量元素Ⅰ和Ⅱ的投量均为1mL/L。COD只在R1进水中投加，R2用作对照。

1.3  试验方法

R1和R2的排水比为50%。在反应器进水完成后，以间歇曝气（搅拌∶曝气=30min∶30min）模式运行，HRT视系统性能而定，为16~48h，运行温度控制在（32±2）℃，pH控制在7.8左右。试验共分为启动、稳定运行、负荷提升三个阶段，具体运行参数见表1。

1.4 分析方法

反应器进出水COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度采用国家标准方法进行测定；pH、DO、温度采用便携式多参数分析仪（WTWMulti3620IDS）测定；生物膜厚度采用电子显微镜（OLYMPUSSZX10）进行观察。

亚硝酸盐积累率（NAR）和氮去除负荷（NRR）根据进出水NO2--N、NO3--N、TIN浓度等经计算得到；同步亚硝化-厌氧氨氧化-反硝化系统的氮去除计算方法参照文献。

1.5 16SrRNA高通量测序

1.5.1 样品采集与保存

采集各阶段末期的絮体污泥和生物膜样品，于-20℃冰箱保存。絮体污泥和生物膜样品分别用字母S和B表示，数字1、2、3代表R1和R2的三个不同阶段，如S1-1为R1第一阶段结束时的絮体污泥样品。

1.5.2 IlluminaMiSeq测序

使用FastDNA®SpinKitforSoil试剂盒进行样品总DNA提取。利用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16SrRNA基因V3-V4区进行PCR扩增。PCR产物经回收、定量检测之后，于MiSeqPE300平台上进行高通量测序。经降噪处理后，利用UPARSE软件，按97%的相似度对高质量序列进行操作分类单元（OTU）聚类，利用RDPClassifier对每条序列进行物种分类。

2、结果与讨论

2.1 COD对氮去除的影响

2.1.1 氮去除特性

R1和R2各阶段进出水氮浓度的变化见图1。

在第一阶段前期（1~7d），R1和R2出水NH4+-N浓度较高，平均浓度分别为140.52和199.23mg/L。出水NH4+-N浓度较高的原因可能是，运行前期采用低DO（0.2mg/L）运行模式，在抑制接种污泥中好氧异养菌代谢活性的同时，也影响了氨氧化微生物活性。在第8天将DO调高至1.2mg/L左右，出水NH4+-N浓度快速下降。在第一阶段结束时，R1和R2出水NH4+-N浓度分别为0.43和5.45mg/L。被降解的NH4+-N大多转化为NO3--N，R1和R2出水NO3--N浓度分别为229.90和235.55mg/L，表明R1和R2中亚硝酸盐氧化菌（NOB）的活性较高。

为抑制NOB活性和实现部分短程硝化，阶段二采用间歇曝气和低DO（0.5mg/L）的运行策略。在该阶段，R1出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N平均浓度分别为123.05、94.44和9.67mg/L，R2出水平均浓度分别为173.51、172.83和22.32mg/L。R1和R2在第二阶段的平均NAR分别为94.11%和89.27%，表明NOB活性已被充分抑制。有研究表明，NOB的氧半饱和系数明显高于AOB，在与AOB竞争DO时往往会处于劣势地位，再加上NOB历经缺氧到好氧环境的活性恢复较AOB滞后，因此缺/好氧交替环境能够有效抑制NOB活性，进而保证部分短程硝化的稳定运行。在该阶段，R1平均进出水TN分别为397.62、227.16mg/L，平均去除率为42.87%，其中Anammox途径贡献了90.15%的TN损失，而反硝化途径仅去除9.85%的TN。R2的TN平均去除率为7.64%，仅为R1的17.82%。以上结果表明，低COD/N有助于提高PNA-MBBR系统的脱氮效率。吕永涛等发现当COD为50mg/L时，Anammox系统的总氮去除率比不加COD时提高了7.57%。尽管COD的存在有利于提高反硝化菌在与AnAOB竞争底物过程中的优势，不利于Anammox活性的维持，但对于多种脱氮功能菌共存的一体式泥膜复合PNA-MBBR系统来说，反硝化菌可以利用进水COD作为电子供体，将系统中上周期残留的NO2--N还原为氮气，降低了系统中NO2--N的浓度（R1平均出水NO2--N浓度为R2的54.65%），进而缓解高浓度NO2--N对AnAOB的毒害作用，有利于提高系统的脱氮性能。

为进一步提高R1和R2的脱氮性能，第三阶段运行期间分别对R1和R2进行延长HRT和降低DO浓度的调整。R1的TN平均损失和平均去除率分别为213.87mg/L和52.93%，较阶段二分别提高了25.47%和23.47%。R2出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N平均浓度分别为208.21、148.54和12.72mg/L，TN平均去除率（8.45%）较上一阶段提高了10.60%。此时R1平均NRR为0.23kg/（m3·d），其中92.70%的TN损失通过Anammox途径去除，R2平均NRR仅为0.06kg/（m3·d）。

2.1.2 COD去除特性

R1在各阶段的出水COD平均浓度分别为41.56、41.74和42.13mg/L，平均去除率分别为91.73%、91.68%和91.69%，表明R1在不同阶段均表现出良好的COD去除性能。镜检显示，在第三阶段结束时，R1和R2中生物膜平均厚度分别为（351.76±67.93）μm和（148.96±44.48）μm，表明COD的存在有助于填料迅速挂膜。较厚的生物膜可缓解DO对生物膜内层AnAOB的冲击作用，有利于维持AnAOB的活性。R1和R2出水中均残留有较高浓度的NO2--N，在经过0.5h缺氧搅拌后，R1中NO2--N浓度50mg/L（见图2），表明在R1进水和前置缺氧0.5h过程中，COD可作为反硝化的电子供体，用于去除系统中残留的NO2--N。

此外，在间歇曝气过程中，COD浓度呈逐步降低趋势，且R1在阶段二和阶段三的出水NO3--N平均浓度分别为9.67和10.19mg/L，低于Anammox理论NO3--N产量（20.07和25.02mg/L），说明在间歇曝气过程中，存在NO3--N的还原。因此，进水中的COD不仅有利于PNA-MBBR系统快速挂膜，还可有效去除残余的NO2--N和Anammox产生的NO3--N，降低NO2--N的不利影响，有助于PNA-MBBR系统的启动和深度脱氮。

2.1.3 R1和R2典型周期的氮素转化规律

为进一步研究COD对系统脱氮的影响，对R1和R2在第二和第三阶段末期的典型周期进行分析，结果见图2。对于阶段二，经过0.5h缺氧搅拌后，R1和R2中NO2--N浓度分别为1.17、107.90mg/L。在R1中，NH4+-N浓度从混合后的241.6mg/L减少至80.75mg/L，出水NO2--N和NO3--N浓度分别为100.59、1.21mg/L，TN去除率为54.90%。在R2典型周期中，随着NH4+-N降至118.73mg/L，NO2--N浓度由107.90mg/L逐步增至200.98mg/L，远超R1出水NO2--N浓度；此时，出水NO3--N浓度和NAR分别为36.23mg/L和84.73%，TN去除率仅为11.93%。有研究表明，NO2--N作为一种解偶联剂会增加细胞膜的渗透性，影响胞内电子传递和质子转移相关的酶，进而对ATP的合成产生抑制作用，从而降低AOB和Anammox菌的活性。R2出水NO2--N浓度远超其对Anammox菌的抑制阈值100mg/L，推测这是其脱氮性能受到抑制的主要原因。

在阶段三，R1出水NO2--N浓度为20.01mg/L，与阶段二相比大幅度降低；在周期结束时出水COD、NH4+-N和NO3--N浓度分别为45.00、119.96和1.54mg/L，TN去除率由阶段二的54.90%增加至65.19%。R2出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度分别为227.36、100.44和13.83mg/L，其中出水NO2--N浓度较阶段二明显下降；此时R2的NRR为0.10kg/（m3·d），较阶段二提高了12.62%。

2.2 微生物群落结构分析

2.2.1 微生物多样性分析

R1和R2不同阶段絮体污泥和生物膜样品的微生物多样性如图3（a）所示。R1和R2絮体污泥样品的Shannon指数均为先上升后下降，在第二阶段达到了最大值。R1生物膜样品的Shannon指数一直上升，在第三阶段达到了最大值，但仍低于R2生物膜样品的多样性。图3（b）展示了R1和R2絮体污泥和生物膜样品中OTU（数量分别为416、443、570、751）的差异性。4组样品中共有的OTU为239，仅占总OTU（2180）的11%，说明R1和R2两个反应器中微生物群落结构发生明显的变化。无论是絮体污泥还是生物膜样品，R2的总OTU均高于R1。

2.2.2 门水平微生物群落结构分析

R1和R2絮体污泥和生物膜样品在门水平上的微生物群落结构见图4。Proteobacteria、Bacteroidota和Chloroflexi是所有样品中的优势菌门，与已报道的PNA系统微生物群落结构相似。Proteobacteria的相对丰度在R1和R2中呈现不同的变化规律。无论是在R1絮体污泥样品还是在生物膜样品中，Proteobacteria的相对丰度均呈下降趋势，分别从S1-1、B1-1的67.26%和79.97%下降至S1-3、B1-3的11.16%和37.67%，而在R2中则表现出与R1相反的变化规律，分别从S2-1、B2-1的61.30%和17.06%上升至S2-3、B2-3的74.05%和50.78%。Bacteroidota在R1和R2絮体污泥样品中的相对丰度变化不明显，但随着反应器运行，其在生物膜样品中的相对丰度有所增加，在B1-3和B2-3样品中的相对丰度分别为12.56%和17.01%。Chloroflexi在R1和R2生物膜样品中的平均相对丰度（23.77%和21.84%）均高于其在絮体污泥样品中的平均相对丰度（9.53%和8.69%）。目前已报道的AnAOB均属于Planctomycetota，其在B1-3和B2-3的相对丰度分别为0.42%和0.13%，均高于同时期在絮体污泥样品中的相对丰度（0.16%和0.05%），且其在R1阶段二和阶段三样品中的平均丰度为0.53%，高于R2中的0.21%。

2.2.3 属水平微生物群落结构分析

为进一步探究COD对脱氮功能微生物群落结构的影响，对R1和R2絮体污泥和生物膜样品的硝化菌属、Anammox菌属和反硝化菌属进行分析，结果见图5。Nitrosomonas是R1和R2中主要的AOB菌属。在R1絮体污泥和生物膜样品中，Nitrosomonas的相对丰度均呈下降趋势，从S1-1、B1-1的3.61%和1.15%分别下降至S1-3、B1-3的2.64%和0.42%。而在R2中，Nitrosomonas的相对丰度从S2-1、B2-1的13.94%和3.67%分别增长至S2-3、B2-3的37.81%和13.91%。在R1和R2中均是絮体污泥样品的Nitrosomonas平均丰度（3.28%和21.25%）大于生物膜样品的平均丰度（0.69%和10.53%），这可能是由于AOB在填料生态位竞争中处于劣势所导致，王智辉在泥膜复合PNA系统启动研究中发现了同样现象。Nitrospira和Nitrolance为NOB菌属，只在第一阶段检测到。随着反应器运行，NOB逐渐被淘洗出系统，这与R1和R2在阶段二和阶段三表现出较好的短程硝化效果相对应。

在高通量测序中，没有在属水平检测到Anammox相关菌属序列，可能是R1和R2中AnAOB丰度较低和高通量测序灵敏度不足所致，Wang等也报道了类似情况。此外，SM1A02菌属属于Planctomycetes菌门，与AnAOB密切相关，在一些研究中被认为是“潜在的新型AnAOB”。因此，分析了SM1A02菌属在各样品中的变化。由图5（b）可知，SM1A02在R1和R2絮体污泥样品中的相对丰度相当，分别为0.04%和0.03%。但SM1A02在R1生物膜样品中的相对丰度远高于R2，尤其在阶段二和三中，其在R1中的相对丰度分别为0.33%和0.28%，而在R2中仅为0.08%和0.06%，说明载体生物膜有利于持留AnAOB这类生长缓慢的微生物，且低COD/N条件有利于其富集生长，为氮的稳定去除提供保障。

R1和R2分别检测出9种和17种反硝化菌属，且Thauera的平均相对丰度最高，其在R1和R2中分别占总反硝化菌属的93.31%和58.28%，这与其他文献中结果类似。对于R1的絮体污泥和生物膜样品，Thauera的相对丰度分别从S1-1、B1-1的52.01%和65.29%下降至S1-3、B1-3的3.52%和11.27%，在R2中的相对丰度则从S2-1、B2-1的31.71%和3.03%下降至S2-3、B2-3的0.53%和1.56%。值得注意的是，R1中Thauera在反硝化菌属中始终占据主导地位，而Hydrogenophaga、Hyphomicrobium和Comamonas等在R2中反硝化菌的占比有所上升。有研究表明，当分别以葡糖糖和乙酸钠为碳源时，系统中的优势反硝化菌属均为Thauera，其相对丰度分别高达58.69%和70.62%。因此，推测R1进水中的葡萄糖和乙酸钠有利于Thauera的专属富集，使其成为R1中的绝对优势反硝化菌属，进而降低R1反硝化菌属多样性。

2.2.4 属水平上差异物种分析

为研究R1和R2中絮体污泥和生物膜的微生物种群结构差异，在属水平对R1和R2第二、三阶段的絮体污泥和生物膜样品进行差异分析。结果表明，R1和R2总微生物群落共有28个菌属存在显著差异，其中在R1中仅有8个菌属的丰度显著高于R2，而R2显著富集了20个菌属。如Thauera菌属在R1中的相对丰度是R2的4.8倍，OLB8、Dokdonella和Hydrogenophaga等菌属在R2中的相对丰度远高于R1。分别对比R1和R2的絮体污泥群落以及生物膜群落发现，无论是絮体污泥还是生物膜，均是R2中显著富集的菌属多于R1，这与总微生物群落分布相对应。Arenibacter、Paludibaculum和Aeromonas等菌属在R1絮体污泥中的相对丰度较高，而R2絮体污泥中富集的菌属为Hyphomicrobium、Bosea和Rhodobacter等。对于生物膜样品，R1中富集的菌属均与脱氮密切相关，分别为Defluviicoccus、SM1A02、OLB13和Thauera，其中Defluviicoccus作为一种常见的聚糖菌（GAOs），具有内碳源反硝化作用。研究表明GAOs偏好于以乙酸作为碳源，R1进水中的乙酸盐可能是Defluviicoccus得以富集的主要原因。宏基因组学研究表明，OLB13含有编码呼吸氨化、NO2--N解毒以及CO2固定途径所需关键酶的基因，这些途径可与AnAOB相互作用，进而有助于AnAOB在R1中生长。此外，OLB13还具有短程反硝化作用。Nitrosomonas在R2生物膜样品中被显著富集。对比同一反应器中絮体污泥样品和生物膜样品可以发现，均是生物膜中显著富集的菌属数量高于絮体污泥，这得益于填料上分层的生物膜结构，可为多种微生物提供合适的生存环境。

3、结论

①R1进水中的有机物可有效降低系统NO2--N浓度和促进填料快速挂膜，有助于PNA-MBBR工艺的启动。

②R1和R2在负荷提升阶段的平均总氮损失分别为0.23、0.06kg/（m3·d）。R1中Anammox和反硝化两种脱氮途径对总氮的去除贡献分别为92.70%和7.30%。

③一体式泥膜复合PNA-MBBR系统中的优势AOB为Nitrosomonas，主要分布在絮体污泥中，SM1A02主要分布在填料生物膜中，且其在R1生物膜样品中的相对丰度远高于同时期R2生物膜样品。Thauera是R1絮体污泥和生物膜中具有绝对优势的反硝化菌属。

④R2中总微生物群落多样性高于R1。R1和R2中的生物膜显著富集菌属数量高于絮体污泥。