近年来，氮素污染导致的水体富营养化现象频发，严重威胁水生态环境和人类健康。对市政污水、工业废水、农业废水等的氮素去除成为环境领域迫切需要解决的问题之一。传统的生物脱氮工艺涉及硝化和异养反硝化过程。但是异养反硝化存在剩余污泥产量大、温室气体N2O积累以及需要外加碳源等问题。而硫自养反硝化工艺利用还原态硫为电子供体，可将污水中的硝酸盐氮和亚硝酸盐氮转化为氮气，相比传统异养反硝化工艺，具有无需外加碳源、剩余污泥产量小等优点，可降低污水处理成本、减少温室气体的排放。此外，基于颗粒污泥的硫自养反硝化工艺，相比絮状污泥，具有更高的密度和更好的沉降性能，有利于厌氧生物脱氮工艺的高效进行。颗粒污泥是具有自我平衡性能的微生态系统，可为多种微生物共存提供良好的微生态环境，同时颗粒污泥的特殊紧凑结构而提供的屏蔽作用，可以保护微生物免受外部不利条件的影响。

在实际工程应用中，颗粒污泥不易培养获得，故反硝化反应器启动时颗粒污泥的接种以及系统故障时再次添加颗粒污泥的需求与颗粒污泥的储存和运输及其后续活性恢复密切相关。通常情况下，相较于储存过程，运输过程时间较短，且经运输后颗粒污泥形态保存完好，再重新培养一周即可恢复原有活性水平。但在污水厂实际运行过程中，由于行业的季节性停产、年度维护、设备检修等问题，污水水流可能会完全停止几周甚至几个月，从而影响反硝化颗粒污泥的活性及形态。因此，对长期储存的反硝化颗粒污泥进行活性恢复及形态再生具有重要意义，而目前鲜有这方面的研究。此外，低温储存条件下，颗粒污泥新陈代谢活动受到抑制，对维持污泥活性和形态完整性十分有利；同时，与干式储存和超低温储存相比，低温储存的程序简单且成本较低。鉴于此，笔者将成熟的硫自养反硝化颗粒污泥置于4℃冰箱内保存60d后取出进行再生实验，通过比较再生期间的污泥反硝化活性、理化性质以及微生物群落结构变化，探讨硫自养反硝化颗粒污泥脱氮活性及颗粒形态快速恢复的机制，以期为反硝化颗粒污泥的快速再生提供理论支撑和技术指导，同时为反硝化颗粒污泥系统的构建以及污水处理效果的提升提供新思路。

1、材料与方法

1.1 实验装置与进水水质

实验所用装置为升流式厌氧污泥床（UASB）反应器，有效体积为2L，设有三相分离器和回流管，如图1所示。

实验进水采用模拟污水，主要组分包括NO3--N、S2O32--S以及微生物生长所必需的营养液和微量元素。其中，营养液的组分如下：NH4Cl为115.0mg/L，NaHCO3为780.0mg/L，CaCl2为1.8mg/L，MgCl2·6H2O为8.5mg/L，KH2PO4为9.0mg/L，K2HPO4为24.0mg/L；微量元素组分如下：FeCl3·6H2O为2.5mg/L，H3BO3为0.25mg/L，CuSO4为0.0625mg/L，KI为0.1mg/L，MnSO4·4H2O为0.3125mg/L，ZnSO4·7H2O为0.1875mg/L，CoCl2·6H2O为0.25mg/L。

1.2 接种污泥

储存前的污泥取自实验室长期稳定运行的UASB反应器，进水NO3--N和S2O32--S浓度分别为70和350mg/L，进水氮负荷为1.68kg/（m3·d），水力停留时间（HRT）为1h，上升流速为3.06m/h，硝态氮平均去除率为95.77%，氮去除负荷为1.61kg/（m3·d），具有良好的反硝化效能，颗粒污泥平均粒径为0.694mm，污泥浓度MLSS为7.01g/L、MLVSS为4.96g/L，污泥体积指数SVI5和SVI30均为20.10mL/g，胞外聚合物（EPS）中多糖（PS）和蛋白质（PN）含量分别为29.37和178.64mg/g。实验以在4℃、不添加基质条件下储存60d的硫自养反硝化颗粒污泥作为接种污泥。

1.3 实验方法

将储存60d的硫自养反硝化颗粒污泥接种至UASB反应器中，控制运行温度为（30±1）℃，污泥停留时间（SRT）为60d，进水NO3--N和S2O32--S浓度分别为70和350mg/L，上升流速为3.06m/h。污泥恢复实验分为3个阶段，各个阶段的运行参数见表1。

1.4 分析项目与方法

NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐分光光度法测定；NO3--N采用紫外分光光度法测定；MLSS、MLVSS、SVI采用国家标准方法测定；颗粒污泥的粒径采用激光粒度仪测定。

EPS采用热提取法进行提取，具体如下：取15mL泥水混合物以4000r/min离心5min，倒掉上清液后将颗粒污泥重悬于15mL、70℃、0.05%的NaCl溶液中，涡旋1min后，以4000r/min离心10min，上清液即为疏松型EPS（L-EPS）；将留在离心管中的颗粒污泥重悬于0.05%的NaCl溶液中，直至其原始体积，将其在80℃水浴中加热30min，然后将污泥混合物以4000r/min离心15min，上清液即为紧密型EPS（T-EPS）。PS和PN含量分别采用考马斯亮蓝试剂法和蒽酮硫酸试剂法测定。

采用高通量测序技术分析硫自养反硝化系统中微生物的多样性和群落结构。采用E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit（OMEGA，USA）试剂盒对颗粒污泥进行DNA抽提，在MiSeq测序平台选择V3-V4区域通用引物338F/806R进行PCR扩增，将扩增后得到的序列与Silva数据库中的微生物进行比较。污泥样品取自储存前一天、储存阶段的最后一天以及恢复阶段的最后一天。

2、结果与讨论

2.1 污泥脱氮性能恢复

采用低浓度进水和较长HRT来启动恢复实验，然后通过逐步缩短HRT来提高脱氮负荷。整个实验分为3个阶段，各个阶段反应器的脱氮效果如图2所示。

在S1阶段，HRT为8h，进水硝态氮浓度为70mg/L，进水氮负荷为0.21kg/（m3·d），经过10d的运行，硝态氮去除率达到83.32%，污泥的反硝化活性有一定程度的提高，出水亚硝态氮浓度在前6d较高，但后期都维持在较低水平（<0.5mg/L）。S2和S3阶段通过增大进水流速来提高进水负荷。在S2阶段，硝态氮去除率达到了95%左右。在S3阶段，提高进水硝态氮负荷至1.68kg/（m3·d），硝态氮去除率因HRT的降低而短暂下降，但在培养过程中逐渐升高，硝态氮去除率保持在90%以上，最高达到94.79%，氮去除负荷达到1.59kg/（m3·d），基本达到了储存前的脱氮效果。

2.2 污泥形态及粒径恢复

培养初期，污泥大部分为结构松散的深褐色絮状污泥，污泥平均粒径为0.137mm（见表2）。在S1阶段，反应器内气泡产生较少，且污泥形态与初始污泥形态相比无明显变化。

在S2阶段，逐步提高进水流速，缩短HRT，强化富集反硝化菌。随着HRT的降低，观察到反应器中出现污泥上浮现象，大量密度较低的絮状污泥开始从反应器中流失。为了维持UASB反应器良好的反硝化性能，人为地将流失的絮状污泥再次泵入反应器中。此外，调整反应器内循环比（5→3），以缓解污泥流失。在此阶段，反应器内产气量增加，至该阶段末期，反应器底部出现黄色和白色的沙化污泥，平均粒径为0.255mm，其为反硝化颗粒污泥形成的初始状态。

在S3阶段，再次提高进水流速，该阶段反应器内形成了大量白色或黄色的反硝化颗粒污泥，平均粒径为0.658mm，达到储存前的94.81%，表明通过50d的恢复培养，基本可以完全恢复颗粒污泥的原有形态和粒径，远小于硫自养反硝化颗粒污泥的启动时间（在Qian等人的研究中，成熟的硫自养反硝化颗粒污泥的形成时间为150d）。

2.3 EPS含量变化

EPS主要由PN和PS组成，在颗粒污泥的形成和稳定过程中发挥着重要作用。研究表明，EPS可以通过自身含有的羟基、羧基等官能团与阳离子产生静电结合作用，促进微生物间的黏附聚集，加速颗粒污泥的形成。此外，在污泥颗粒化过程中，PS和PN发挥不同的作用：PN中带负电荷的氨基酸含量很高，因此与PS相比，PN在具有多价阳离子的电键中参与度更高，这是稳定微生物聚集体结构的关键因素；而PS分布于菌胶团的细胞间隙中，形成的网状结构有利于微生物的聚合并维持其完整性。因此，本研究在颗粒污泥不同恢复阶段提取L-EPS和T-EPS并测定其中的PS、PN含量，结果如图3所示。在第10天，EPS含量得到一定程度的恢复，PS、PN含量分别由初始的16.30、79.41mg/g增加到21.39、85.57mg/g。在S2和S3阶段，随着进水流速的增加，EPS含量进一步提高，在第50天PS和PN含量分别达到了26.25和166.81mg/g，分别较初始阶段升高了61.04%和110.06%，达到了储存前的89.38%和93.38%。同时，PN/PS值整体呈现上升的趋势，从初始的4.87升高至第50天的6.35，颗粒污泥的EPS中PN成分占主导。总之，经过50d的培养恢复，颗粒污泥的EPS含量有了较大的增长并逐渐接近储存前的水平，尤其是PN含量，有研究指出，蛋白质是决定颗粒污泥聚集能力的主要因素，这些结果进一步证明了硫自养反硝化颗粒污泥形态的成功恢复。

2.4 污泥理化性质变化

颗粒污泥恢复过程中的理化性质变化如图4所示。由图4（a）可知，初始污泥的MLSS和MLVSS分别为4.57和1.90g/L，在恢复的开始阶段MLSS出现一定的下降，推测可能是污泥颗粒破碎导致一部分小碎片污泥随水流排出反应器，使得污泥量下降。之后，随着反应器内硝态氮负荷的不断提高，微生物获得了充足的生长基质，开始大量繁殖，污泥量不断升高。至第50天，MLSS与MLVSS分别增长至6.53和4.59g/L，达到储存前的93.15%和92.54%。MLVSS/MLSS值由初始的0.42逐渐升高并最终维持在0.70左右，表明硫自养反硝化颗粒污泥中的活性成分较高。

SVI常用于反映污泥沉降性，有研究表明，结构密实、沉降性好、SVI值较低的颗粒污泥更容易在较高的水力剪切力下形成，当SVI5和SVI30相差小于10%、最小粒径≥0.2mm时，可以认为颗粒化成功。污泥的沉降性能变化如图4（b）所示。可以看出，在整个运行过程中，SVI5与SVI30均不断降低并趋于一致，SVI5从初始的52.29mL/g降至20.33mL/g，SVI30则从37.09mL/g降至20.33mL/g，此时系统内可观察到明显的污泥颗粒化现象。结合SVI值以及2.2节测得的污泥粒径（平均粒径为0.658mm），可以认为经过50d的恢复培养反硝化污泥已成功颗粒化。

2.5 污泥微生物特征变化

储存前后以及恢复后的污泥微生物多样性如表3所示。可知，恢复后颗粒污泥的α多样性指数与储存前相近，Ace、Chao和Shannon指数高于储存后的水平，而Simpson指数低于储存后，表明恢复后颗粒污泥具有较高的微生物丰富度。

图5为不同阶段污泥微生物群落结构在门水平和属水平上的变化。

在门水平上，Campilobacterota和Proteobacteria是主要的优势菌门，两者的相对丰度在储存前分别为65.51%和17.80%，在储存后变为26.31%和39.51%，经过50d的恢复培养后分别达到57.98%和32.21%，变化趋势与反应器的脱氮效果一致。已有的研究表明，在硫自养反硝化反应器中发现Campilobacterota和Proteobacteria为自养环境中的优势菌门，主要的硫氧化菌属于Campilobacterota和Proteobacteria。

由图5（b）可知，反应器中污泥的优势菌属为自养反硝化菌属Sulfurimonas和Thiobacillus，分别属于Campilobacterota和Proteobacteria菌门，两者的相对丰度分别从储存前的71.08%和7.22%降至储存后的26.41%和4.06%；经过50d的恢复培养后，两者的相对丰度升至58.03%和21.17%，其相对丰度的变化趋势与反应器的脱氮性能一致。研究表明，Sulfurimonas和Thiobacillus具有自养反硝化功能，可以利用S2O32--S作为电子供体进行自养反硝化。值得注意的是，储存前与恢复后Sulfurimonas和Thiobacillus的相对丰度略有不同，由于恢复过程中进水基质、HRT、回流比、上升流速等参数与储存前一致，因此推测可能由于储存前培养温度为（25±1）℃，恢复中的培养温度为（30±1）℃，而Thiobacillus的最适培养温度为28~32℃。此外，反应器中还存在一些异养反硝化菌属，例如Denitratisoma和Terrimonas，恢复后其相对丰度分别为3.42%和0.21%，储存前的相对丰度分别为2.51%和0.26%。原因可能是在反应器实际运行过程中，部分细菌裂解/衰变产生的可溶性微生物产物、胞外聚合物或内碳源等有机物可被其他异养细菌用于再生、内源呼吸和反硝化过程，从而导致系统内存在少量的异养反硝化菌。自养和异养菌群之间可能存在协同作用，使得反硝化系统具有较高的脱氮效果。

3、结论

①硫自养反硝化颗粒污泥在4℃下储存60d后，接入UASB反应器进行恢复培养，运行50d后污泥的反硝化性能基本完全恢复，氮去除负荷高达1.59kg/（m3·d），平均粒径为0.658mm，接近储存前的水平（0.694mm）。

②在颗粒污泥恢复过程中，PS和PN含量均有不同程度的增长，结合颗粒污泥的形成及其理化性质的变化，可以认为颗粒污泥的有机成分含量提高，相应生物量也有一定的增长，同时胞外聚合物有利于颗粒污泥结构的形成和稳定，即硫自养反硝化颗粒污泥具有丰富的生物相和较高的生物量，在颗粒结构和脱氮性能方面都具有较好的优势。

③在恢复后的污泥体系中，参与硫自养反硝化的菌属（Sulfurimonas和Thiobacillus）相对丰度达到79.20%，在颗粒污泥反硝化过程中发挥着关键作用。