厌氧-缺氧-好氧(anaerobic-anoxic-oxic，AAO)工艺作为传统活性污泥法的典型工艺，因其工艺成熟、流程简单、运行灵活、水力停留时间短、建造和运行成本低等优点广泛应用于我国城镇污水处理体系中。然而，我国北方地区温度差异大，寒冷季节长，生化处理过程受影响较大，小规模污水处理难以稳定达标。低温使硝化和反硝化菌属活性降低，导致系统脱氮效能恶化，为系统稳定运行带来极大挑战。因此，提高AAO系统的脱氮性能，以保证冬季低温条件下污水处理系统的稳定运行效果，是目前研究重点与难点。

已有研究结果表明，温度对AAO系统的脱氮效能有很大影响。RANDALL等发现，当温度由20℃降至10℃时，相应的污泥龄需要从2.7d延长至5d才可保证AAO系统的硝化效果。梁嘉斌等利用Sumo软件对冬季某污水厂运行情况进行动态模拟和优化，结果表明：硝化液回流比从50%提升到400%时，系统脱氮效果有所增加而COD去除率变化不大，将硝化液回流比优化为300%、DO为1.95g·m−3(每立方米污水中的氧气质量)后TN明显降低；雒海潮等对分流式测流-AAO系统在12~15℃下污染物去除性能进行研究，发现改良AAO系统对COD、(NH4+-N)和TN的去除率分别为88.56%、83.12%和71.60%，且可实现良好的污泥减量效果；WANG等发现将AAO与曝气生物滤池(biologicalaeratedfilter，BAF)耦合可有效增强系统低温条件下的脱氮除磷效果；金羽对AAO系统的研究表明，在11℃下，系统出水TP、COD仍能满足一级A标准，而14℃时AAO系统就对NH4+-N和TN的去除效果明显下降，难以达到排放标准。

在不增设工艺单元的低温条件下，常规AAO系统难以满足排放要求，因此应探究低温条件下AAO系统微生物特性，并通过工况调整等非工程措施来提高脱氮性能，尤其是提升NH4+-N和TN的去除效果。为保证低温条件下系统的稳定运行，多采用对构筑物保温、降低污泥负荷、延长水力停留时间(HRT)或结合物化方法等措施来提高脱氮效能。但上述方法不仅难以实现稳定的出水效果，还极大地增加污水处理设施的基建和维护运行费用，因此，对AAO工艺的改良应在充分发挥AAO工艺本身功能的基础上有针对性地进行。硝化液回流比和污泥回流比是AAO工艺最典型的2个内部参数。相较于增加工艺单元或采用保温措施、降低污泥负荷等工程措施，内部参数的调整不会大幅增加基建和运行费用，但会直接影响系统硝化性能和污泥浓度，进而影响各指标处理效果。

基于此，本研究以小试规模的AAO污水处理系统为研究对象，通过调整硝化液回流比、污泥回流比和碳源等条件，获取低温条件下AAO系统最佳运行工况，并结合胞外聚合物(EPS)和微生物群落结构，探究低温条件下AAO系统的脱氮机理、微生物群落与脱氮除碳之间的关系，以期为低温状况下污水处理效能的提升提供参考。

1、材料与方法

1.1 实验水质及接种污泥

接种污泥取自西安市第四污水处理厂回流污泥，取样日期为2月6日。取样时水厂水温13.5℃，1、2月份水厂水温波动小，均低于14℃。实验采用人工配水模拟农村生活污水，所用试剂包括：葡萄糖，乙酸钠，氯化铵，磷酸二氢钾及微量元素溶液，微量元素添加量为1mL·L−1，其成分如表1所示。运行期间水质参数如下：COD为226~289mg·L−1，平均值为249mg·L−1；NH4+-N为18~24mg·L−1，平均值为21mg·L−1；TN为24~30mg·L−1，平均值为27mg·L−1；TP平均值为2.47mg·L−1；pH为6.9~7.6，平均值7.2。

1.2 分析方法

常规指标(NH4+-N)、、、TN和COD分别采用纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法、紫外分光光度法、过硫酸钾氧化法、和快速消解法测定。pH和溶解氧采用便携式溶氧仪(HachHQ40d)测定；温度采用温度计测定。

EPS采用热离心方式进行提取，分别采用苯酚-浓硫酸法和Lowry法对多糖和蛋白进行测定。采用16SrRNAAmplicon高通量测序技术对低温条件下AAO系统中微生物进行群落结构分析。采用MiSeqPE300测序模式，选择细菌16SrRNAV3~V4区引物338F和806R(引物序列5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对样品进行测试，再研究所得样本的群落结构，通过上海美吉生物医药技术公司(上海)的美吉生物技术云平台对样本中优质DNA序列进行了筛查，并对检测数据进行了解析。

1.3 实验装置及运行方式

本研究所采用装置为日处理量30L·d−1的AAO系统(图1)。反应器AAO主反应区总有效容积20L，其中厌氧池2L，缺氧池2.5L，好氧池15.5L。系统总HRT约为16h。在启动期后，主反应区内MLVSS、MLSS分别维持在(1500±50)mg·L−1和(2230±50)mg·L−1，好氧区DO控制在1.5~2mg·L−1。二沉池设计为竖流式沉淀池，有效容积为4L。厌氧池、缺氧池和好氧池设有电动搅拌机。好氧池底部设置曝气头连续曝气，反应器进水、内回流及污泥回流均采用蠕动泵控制。实验通过制冷机(低温恒温槽DC-2010)循环冷却水的方式控温。制冷机内冷却水接入反应器外部循环冷却水槽，保证反应器内水温稳定在(12±0.5)℃。

本实验系统接种污泥后在(12±0.5)℃条件下进行培养和驯化，连续运行168d。系统启动成功后分为3个阶段进行(表2)，每个阶段分别改变系统的硝化液回流比、碳源、污泥回流比，探究其对生活污水处理效果的影响。每阶段所得最优控制条件作为下阶段初始固定参数，不断优化得到低温条件下AAO系统最优控制策略。

2、结果与讨论

2.1 低温条件下AAO系统启动期运行效果

通过人工配置连续进水的方式启动系统，启动期内确定硝化液回流比为200%、污泥回流比为50%。由图2可见，随反应区内污泥浓度升高，系统对COD和NH4+-N去除效果缓慢上升。25d后主反应区内MLVSS上升至1500mg·L−1，出水TN和COD分别小于20mg·L−1和50mg·L−1，表明反应器启动完成，之后开始逐步探究不同工况优化对AAO系统稳定运行的影响。

2.2 低温条件下AAO系统工况优化

1)不同硝化液回流比对污染物去除性能影响。

有研究表明，生物脱氮系统硝化液回流比一般控制在100%~300%。本研究控制AAO反应器在污泥回流比为50%的条件下，以葡萄糖为碳源对系统中活性污泥进行培养，探究硝化液回流比对低温运行的AAO反应器脱氮除磷效能影响。每个工况条件下运行24d，污染物去除效果如图3所示。

当进水平均(NH4+-N)为21.80mg·L−1时，AAO系统在内回流比为100%、200%和300%的工况下出水平均(NH4+-N)分别为8.84、9.46和8.85mg·L−1，平均去除率分别为60.73%、57.28%和56.51%。结果表明：3种硝化液回流比工况下出水(NH4+-N)在《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)的一级B标准之上。当用葡萄糖作为碳源时，以常规AAO系统作为单一处理单元净化污水时，改变硝化液回流比对NH4+-N去除效果影响不大。

进水平均TN为26.90mg·L−1时，AAO系统在内回流比为100%、200%、和300%的工况下出水平均TN分别为16.64、16.34和14.29mg·L−1，平均去除率分别为36.08%、41.35%和46.53%。3种工况结果表明：硝化液回流比为100%、200%时，出水TN可满足一级B标准；尽管300%的硝化液回流比工况对TN的去除效果优于前2种，但不能稳定达到一级A标准。增高的硝化液回流比为缺氧区提供充足的硝酸盐底物进行反硝化作用，本系统中300%硝化液回流比时出水TN最低；而过高的硝化液回流比导致缺氧区水力停留时间变短，且破坏缺氧环境，不利于稳定的反硝化过程进行。

当进水平均COD为249.7mg·L−1时，AAO系统在内回流比为100%、200%、和300%的工况下，出水平均COD分别为24.69、12.42和17.71mg·L−1，平均去除率分别为90.22%、95.11%和92.75%。结果表明：低温条件下以葡萄糖作为碳源COD易被AAO系统去除，净化后3种工况COD均可满足(GB18918-2002)一级A标准，但硝化液回流比由100%提高到200%时，出水COD更低，去除效果更稳定。

2)碳源种类对污染物去除性能影响。

实验结果表明，低温条件下以葡萄糖作为单一碳源导致系统脱氮性能不佳。污水生物脱氮过程中，有机碳源是十分重要的因素，且在实际应用中，生活污水成分复杂，并非由一种碳源组成，脂肪酸、碳水化合物的质量分数分别占约10%、25%~50%。胡小宇等发现，复合碳源(葡萄糖∶乙酸钠=1.5∶1)更利于系统脱氮效能提升。因此，确定在污泥回流比为50%、硝化液回流比为100%的工况下，进一步探究碳源在低温条件下对AAO系统脱氮效能的影响，其结果如图4所示。

在更换复合碳源后，出水(NH4+-N)、TN下降趋势明显。出水平均(NH4+-N)由8.84mg·L−1降至4.35mg·L−1，去除率由60.73%升至79.85%，且系统稳定后基本实现对NH4+-N的完全去除。出水平均TN由16.16mg·L−1降至12.60mg·L−1，去除率由35.98%升至51.32%，可稳定达到一级A排放标准。相对于单一碳源，复合碳源对AAO系统脱氮效能显著提升。

从电子供体角度分析，虽然碳源不同其代谢途径会存在差异，但最后都归集于三羧酸循环。葡萄糖作为碳源提供电子时，需先经过糖酵解途径转化为丙酮酸，再转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环而乙酸钠作为碳源则可直接被微生物利用。从微生物种群的角度来看，脱氮功能菌种类的不同导致其所能利用的有机碳源也存在差异，AAO系统中所接种污泥为混培物，可能含有多种与反硝化有关的细菌。分析认为，由单一碳源优化为复合碳源后脱氮效果的显著提升是由于碳源种类的丰富及其代谢过程中的各种中间代谢产物可被不同的脱氮功能菌利用，从而提高脱氮的效率。在碳源优化后，AAO系统出水由不达标到基本满足一级A排放标准，这表明碳源的种类和代谢途径对生活污水中氮素的去除有较大影响。

3)不同污泥回流比对污染物去除性能影响。

有研究表明，污泥回流比一般控制在50%~100%比较适宜以复合碳源(葡萄糖∶乙酸钠=1.5∶1)对AAO反应器中活性污泥进行培养，系统稳定后探究50%、75%和100%这3种污泥回流比对污染物去除效率的影响，污染物去除效果如图5所示。

进水平均(NH4+-N)为21.00mg·L−1时，AAO系统在污泥回流比为50%、75%和100%的工况下出水平均(NH4+-N)分别为4.31、0.03和1.56mg·L−1，平均去除率分别为79.92%、99.87%和92.59%。结果表明：系统在3种工况下均有较高的NH4+-N去除负荷。75%污泥回流比系统运行期间对NH4+-N去除效果稳定，NH4+-N几乎全部被降解。

进水平均TN为26.70mg·L−1时，AAO系统在污泥回流比为50%、75%和100%的工况下出水平均TN分别为12.60、7.93和10.85mg·L−1，平均去除率分别为51.32%、69.97%和60.62%。结果表明：在添加复合碳源条件下，AAO系统75%污泥回流比的工况可实现对TN稳定、高效的去除，净化后稳定满足一级A标准；当污泥回流比为50%、100%时，出水TN波动较大，效果不稳定。

随污泥回流比的增大，出水(NH4+-N)、TN呈现先降低再增高的趋势，75%污泥回流比工况下脱氮效果最好。污泥回流比的提高使二沉池回流污泥量增加，一方面提高了系统内污泥质量浓度；另一方面延长了系统污泥龄，有利于硝化细菌等世代时间较长的微生物的繁殖，有利于强化硝化作用、提高对NH4+-N的降解效果。

进水平均COD为247.82mg·L−1时，AAO系统在污泥回流比为50%、75%和100%的工况下出水平均COD分别为27.47、30.98和42.32mg·L−1，平均去除率分别为89.07%、87.26%和82.75%。3种污泥回流比工况出水COD均可满足一级B标准。当污泥回流比为75%时，AAO系统对COD有稳定的去除效果，可稳定满足一级A标准。50%工况出水COD较另2种有更大波动，100%污泥回流比工况出水COD稳定，12次检测中仅2次出水COD略高于一级A标准。

综合各指标处理效果，对比考察3种不同污泥回流比工况下AAO系统污水处理效果，结果表明低温条件下75%污泥回流比工况的AAO系统对NH4+-N、TN和COD净化效果良好，且能保持系统稳定运行。金羽研究发现，低温状况下AAO系统最优的污泥回流比为75%，与本研究一致。

2.3 低温条件下脱氮效能分析

低温会使微生物活性和底物利用率下降，从而导致污水处理性能下降。本研究中低温条件下AAO污水处理系统经工况优化调整后达到稳定、高效的脱氮效能，且表现出独特的脱氮特点。为深入探究本研究中低温条件下的脱氮规律和效果，现对AAO系统中3个运行阶段的氮素转移状况进行探讨。图6为本系统中低温条件下氮素转移情况。

硝化液回流比的调整(阶段Ⅰ)对系统脱氮未产生显著影响，3种硝化液回流比出水亚硝氮小于0.5mg·L−1，未出现亚硝态氮积累的现象；出水硝氮质量浓度随污泥回流比的减小呈先升高后下降的趋势，200%硝化液回流比工况下平均出水硝氮质量浓度最高，为3.09mg·L−1。对碳源进行优化后(阶段Ⅱ)，系统脱氮性能快速上升，出水(NH4+-N)逐渐降至0，出水亚硝氮质量浓度开始增高，阶段Ⅱ后期出水亚硝氮质量浓度达到1.90mg·L−1，亚硝氮积累率达到51%，开始出现亚硝氮积累的现象。阶段Ⅲ对污泥回流比进行调整后，系统仍维持了极高的NH4+-N去除率，尤其在75%污泥回流比条件下，亚硝氮质量浓度最高达到2.21mg·L−1，亚硝氮积累率升高到64.1%。

阶段Ⅱ后，NH4+-N降解速率显著提高，亚硝氮浓度和亚硝氮积累率逐渐升高，而COD去除效果下降。分析认为，碳源优化后系统内部短程硝化反硝化作用逐步增强，短程硝化反硝化与传统硝化反硝化相比，亚硝酸盐作为电子受氢体直接参与反硝化作用，可节省反硝化碳源约40%，从而导致系统出水COD升高。众多研究表明，在低温条件下短程硝化进程会遭到破坏，但本研究中AAO系统在12℃时连续运行168d，氨氧化细菌仍表现出较高活性，可在高效降解NH4+-N同时积累亚硝酸盐。JONES认为，若将30℃环境中的氨氧化细菌直接转移到5℃下，会导致其失活，但若逐步降低温度使其逐步适应，氨氧化细菌可根据温度变化，逐渐将细胞膜中的长链饱和脂肪酸部分调整为短链不饱和脂肪酸。虽然这样需要一定时间来进行培养驯化，但可使其在低温下不易“冻结”。本研究结果与文献的结论相吻合，长时间的驯化使得12℃条件下也可进行一定程度的短程硝化反硝化。

2.4 不同工况条件对EPS影响

EPS是一种存在于微生物聚集体细胞外的复杂高分子混合物，其成分涵盖蛋白质(PN)、多糖(PS)、腐殖质、核酸、脂质及糖醛酸多种有机大分子。这些成分间的比例主要取决于提取方法及污泥来源。其中，PN和PS最多，两者占EPS总量的70%~80%。本研究分析了低温AAO系统不同工况下EPS、SEPS、LB-EPS和TB-EPS中PS和PN质量分数的变化规律，结果如图7所示。

3种硝化液回流比工况下EPS总量保持稳定，TB层均为EPS的主要构成，LB-EPS随硝化液回流比的增加呈上升趋势。同时，PN是EPS组成中贡献最大的成分，细胞表面TB层丰富的PN可减轻微生物所受低温等不利条件的影响。当硝化液回流比为200%时，EPS总量达到最高，为132.7mg·g−1。EPS对污泥回流比调控的响应相较于硝化液回流比更明显，EPS总量及PS、PN质量分数与污泥回流比呈显著的负相关。随污泥回流比的增大，EPS总量显著减少，总EPS由164.0mg·g−1降至81.7mg·g−1，PS由56.7mg·g−1降至25.8mg·g−1，PN由164.0mg·g−1降至81.7mg·g−1。PS质量分数同样随污泥回流比增大而减小，3种污泥回流比工况下PS/PN分别为34.6%、33.3%和31.5%。导致这种现象的原因主要有以下几点。一方面，二沉池中的剩余污泥缺乏营养物质补充，微生物为满足生命活动而将表面的EPS作为碳源和能源而分解，导致二沉池中的微生物EPS总量降低。污泥回流比的增大使二沉池中更多的贫EPS微生物聚集体重新进入AAO系统主反应区，从而拉低系统中微生物的EPS量。另一方面，游离亚硝酸会导致TB-EPS中PS和PN质量分数呈现一定程度的降低，随着系统中亚硝氮质量浓度的升高，可能会破坏EPS中有机化合物的结构，刺激EPS中PS和PN的降解，从而导致EPS总量的减少。另外，污泥回流比的增大导致系统内部水利条件改变，高回流比带来的较高的水利剪切可能是EPS总量减少的另一原因。

EPS表面含有较多羧基、磷酸基等带负电荷的官能团，因而整体带负电性。有研究表明，EPS质量分数过高时，微生物聚集体表面负电荷增加从而导致细胞间静电斥力增加，最终导致微生物沉降性能恶化。EPS中多糖与蛋白的比值(PS/PN)能够维持微生物群落的稳定，并影响污泥表面的亲疏水性。PS/PN越低，表示污泥的相对疏水性越高，污泥表面的吉布斯自由能下降，污泥之间的亲和力增加。污泥回流比增加后所引起的EPS质量分数和PS/PN的降低，有利于改善低温条件下污泥的沉降和脱水性能,进而保障系统内较高的污泥质量浓度。从传质的角度来看，EPS作为微生物的外部屏障围绕在细胞周围，必然会影响营养物质进入细胞和微生物代谢产物的排出。有研究表明，EPS质量分数高的微生物聚集体渗透性较差，75%污泥回流比条件下的EPS总量可能在EPS的吸附效果和传质特性间达到平衡，使得系统获得更稳定的脱氮效果。

2.5 低温条件下微生物种群结构特征

12℃条件下AAO污水处理系统门水平和属水平上的微生物种群及其相对丰度如图8所示。同大多数污水处理过程相同，Proteobacteria(变形菌门)占据主要地位，平均相对丰度75.69%；Bacteroideta(拟杆菌门)也占有相对较高的丰度，平均丰度16.84%，二者总丰度超过90%。Proteobacteria是进行脱氮除磷和降解有机物的最主要菌门，其大量存在可以保证活性污泥法系统的正常运行，在污水处理处理中占有主要地位。可见，低温条件对AAO系统优势菌门相对丰度影响较大，Proteobacteria在微生物群落结构中的优势程度被进一步放大。污水处理过程其他常见优势菌门，如Actinobacteria(放线菌门，4.29%)，Firmicutes(厚壁菌门，1.45%)Nitrospirae(硝化螺旋菌门，0.61%)Chloroflexi(绿弯菌门，0.32%)，Acidobacteria(酸杆菌门，0.28%)也在系统中检出，但相对丰度较其他常温下活性污泥法明显偏低。

缺氧区、厌氧区和好氧区之间在属水平上微生物种群和丰度差异性不大，异养硝化好氧反硝化菌属Pseudomonas(假单胞菌属，23.35%)和反硝化菌属Flavobacterium(黄杆菌属，15.63%)为主要优势菌属。Pseudomonas可通过好氧反硝化作用和解磷作用去除氮磷等污染物，低温条件可能促进Pseudomonas的富集，徐凤英发现SBBR系统中温度由24℃降低至10℃时，Pseudomonas的丰度由0.07%升至1.05%，马切切的研究也表明Pseudomonas与温度的Spearman相关性系数呈显著负相关。分析认为，相对于一般的硝化细菌，本研究中相对丰度最高的优势菌属Pseudomonas异养硝化的特性使其能对碳源改变做出更大的响应，对系统脱氮做出更大的贡献。异养硝化好氧反硝化能够在好氧池一个处理单元中实现氮素的去除，这可能是本研究中系统在优化运行后能对氮素达到稳定去除效果的一个原因。Zoogloea(动胶菌属)是活性污泥法中一种常见的兼性菌，能对污水中的有机污染物有效的去除，平均丰度为2.4%。其他脱氮功能属有反硝化聚磷功能菌属Dechloromonas(脱氯单胞菌，3.59%)，Acidovorax(食酸菌属，1.29%)，硝化菌属Nitrospira(硝化螺菌属，0.61%)，反硝化菌属Rhodocyclaceae(0.89%)、Comamonadaceae(从毛单胞菌，0.64%)。Acidovorax具有氢自养反硝化脱氮功能，也可降解污水中难降解的有机物。值得注意的是，Nitrospira作为典型的亚硝酸盐氧化菌(NOB)，在本系统中仅占0.61%，远低于生活污水处理过程中的平均丰度，说明该系统中NOB功能菌群被抑制，脱氮过程以短程硝化为主，与2.3节中亚硝氮积累现象相吻合。

3、结论

1)在12℃条件下，通过运行工况优化，在采用复合碳源、200%的硝化液回流比、75%的污泥回流比时，系统出水COD、NH4+-N、TN的平均值分别为30.98、0.03、7.93mg·L−1，去除率分别为87.26%、99.87%、69.97%。该条件下系统处理效果最佳，且出水远优于一级A标准。

2)在低温条件下，采用复合碳源时，NH4+-N去除效率与NO2−-N积累率显著增高，表明系统中短程硝化过程成为占据主导地位。

3)系统中活性污泥的EPS受硝化液回流比的影响不大；而与污泥回流比呈负相关趋势，PS/PN逐渐减小。

4)系统中Pseudomonas(假单胞菌属)和Flavobacterium(黄杆菌属)总相对丰度可达40%，异养硝化-好氧反硝化成为主要脱氮过程，低温抑制NOB作用，使得短程硝化耦合异养硝化-好氧反硝过程出现，有效提升系统的脱氮性能。