锑（Sb）作为一种类金属元素，被广泛应用于半导体制造、阻燃剂、蓄电池合金和催化领域。然而，Sb长期暴露于环境中对人类健康有严重的负面影响，例如会诱发尘肺病、腹痛、腹泻、皮炎、自然流产和血压升高等疾病，这引起了全世界范围的广泛关注。Sb主要以Sb（Ⅴ）的形式存在于水环境中，据报道，在我国某锑矿冶炼区矿坑排水中检测到Sb（Ⅴ）的质量浓度高达11.4mg/L。此外，虽然Sb（Ⅲ）的毒性比Sb（Ⅴ）更高，但Sb（Ⅲ）在中性pH环境下很容易与硫化物沉淀或被氢氧化铁强烈吸附，通过离心或过滤很容易被去除。因此，选择合适的水处理技术将Sb（Ⅴ）还原为Sb（Ⅲ），对于实施Sb污染修复具有更重要的意义。

目前，用于去除水中Sb（Ⅴ）的技术主要包括物理化学方法和生物方法。传统的物理化学除Sb技术由于成本高而存在各种局限性，例如，膜分离法和电化学法的运行成本较高，而混凝沉淀法和吸附法由于要添加絮凝剂和制备絮凝剂而增加了成本，并可能导致二次污染。生物还原法因其具有低成本、高效率、环境友好等优势，成为处理Sb（Ⅴ）污染最有应用前景的方法之一。迄今为止，大多数关于微生物还原Sb（Ⅴ）的研究都是通过异养微生物（有机物作为碳源和电子供体）进行的。然而，异养还原技术的应用受限于其对有机碳源的强烈依赖性。碳源添加量不足会导致还原效率低下，而过量添加则可能引发有机物残留问题，造成二次污染。与异养还原相比，自养还原过程更简便、安全且成本更低。自养还原可利用氢气（H2）和硫等无机物作为电子供体，通过自身的代谢活动将这些无机物转化为有机物，实现自养生长。研究发现，温度对微生物代谢活动、还原能力以及菌群结构影响显著，低温和高温的极端情况都会对微生物的生长造成一定影响。然而，目前关于温度对H2自养生物还原锑酸盐的影响研究还尚未有相关报道。

本研究首先利用H2对微生物进行驯化，然后接种驯化的微生物对锑酸盐进行还原。通过序批式实验分别研究了不同温度条件下H2作为电子供体生物还原Sb（Ⅴ）的动力学过程，确定了相关动力学和热力学参数，监测了溶液中Sb（Ⅴ）、Sb（Ⅲ）、总锑（TSb）以及pH的变化规律，利用傅里叶红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析表征产物特性。此外，采用高通量测序技术揭示了微生物氢自养还原除锑酸盐过程中的微生物群落结构。

1、材料与方法

1.1 实验装置

氢自养还原锑酸盐序批式反应器为有效容积800mL的广口瓶（1L）。利用高纯度H2发生器（H2纯度>99.999%，TP-3030C型，北京）以（55±5）mL/min的速率向瓶中供应H2，尾气通过出气口进入水封瓶中。通入H2前，先向瓶中通入N2以营造厌氧环境，随后将反应器密封。为保证实验温度恒定，将广口瓶置于恒温水浴振荡器（SHA-BZ，BONAKEJI，中国杭州）中。

1.2 污泥接种及驯化

活性污泥取自河南省郑州市五龙口污水处理厂氧化沟的厌氧池，该活性污泥微生物群落结构复杂，首先对其进行了初步驯化，以得到氢自养Sb（Ⅴ）还原菌，该驯化阶段在室温（25±2）℃条件下进行。驯化过程中Sb（Ⅴ）质量浓度为50mg/L（以Sb计）。合成废水的其他化学组成如下：0.5mmol/LKH2PO4、0.5mmol/LK2HPO4·3H2O、1mmol/LNaHCO3和1mL/L微量元素，所含微量元素组成参考文献。使用1mmol/LNaOH或1mmol/LHCl将溶液pH调至7.5±0.2。此后，先用N2曝气5min，以除去溶解在溶液中和来自顶部空间的氧气。以12h为一周期向反应体系中通入H2，每周期持续通入3h，H2流量设置为（55±5）mL/min。当Sb（Ⅴ）去除率>99%时，更换体系内的合成废水，并开始新的适应期。

1.3 实验条件

本研究选择Sb（Ⅴ）质量浓度为10mg/L（以Sb计）来测试氢自养生物还原对Sb污染水体的净化效果。将驯化后的活性污泥加入到每个反应器中，并根据设计的Sb（Ⅴ）浓度配制废水。取一定量的初步驯化污泥进行控温驯化，水温分别为30、20、10℃，微生物在对应温度下适应（驯化）10个周期后进行温度影响实验，此时认为不同温度条件下，微生物反应活性和种群结构已经趋于稳定，可以用于后续的性能测试和生物群落分析。开展温度的影响实验，分析不同温度条件下的Sb（Ⅴ）生物还原情况，H2流量为（55±5）mL/min。其他操作条件与初步驯化期一致。实验过程中，定期取样进行检测。

1.4 分析方法

所有样品在分析之前都采用0.22μm的水系滤膜进行过滤，于4℃的冰箱中储存。Sb（Ⅴ）的测定采用离子色谱法（ICS-2100，DIONEX）。TSb浓度采用原子荧光光度法（AFS-8220，北京吉天）测定，Sb（Ⅲ）的浓度由差量法确定，即TSb减去Sb（Ⅴ）。pH采用雷磁pH仪（PHS-3C，上海雷磁）测定。利用NicoletiS50傅里叶变换红外光谱仪（FTIR，FTIR650S，美国赛默飞世尔）来表征反应沉淀物的官能团和化学组成。X射线光电子能谱（XPS，ThermoSci-entificK-Alpha，美国赛默飞世尔）用于分析样品的表面元素组成和价态。

1.5 动力学拟合

分别采用生化反应常见的零级反应动力学和Michaelis-Menten模型对Sb（Ⅴ）还原动力学进行拟合，拟合公式如式（1）和式（2）所示。

零级动力学：

式中：S——初始Sb（Ⅴ）质量浓度，mg/L；t——反应时间，h；k0——零级反应速率常数，mg/（g·h），以单位质量VSS在单位时间内去除的Sb（Ⅴ）质量计；qmax——最大比底物利用率，mg/（g·h），以单位质量VSS在单位时间内去除的Sb（Ⅴ）质量计；Ks——半饱和常数，mg/L；X——微生物质量浓度，g/L。

1.6 微生物取样及测序

1.6.1 微生物取样及编号

微生物氢自养驯化过程中，收集接种污泥和氢自养驯化微生物样品，并分别标记为H0和H15。分别在30、20、10℃反应结束后从反应器中取微生物样品，标记为T30（30℃）、T20（20℃）、T10（10℃）。所有样品储存于-20℃条件下。

1.6.2 高通量测序方法

DNA的提取通过E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit试剂盒来完成，并用分光光度计定量其浓度。PCR扩增是以引物341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）对细菌16SrRNA基因的V3~V4区进行扩增。选择2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，SanPrep柱式DNA胶被用于提取试剂盒回收。通过Qubit3.0DNA检测试剂盒对回收的DNA进行精确定量。利用IlluminaMiseq2×300，对其进行上机测序。OTUs、α多样性、β多样性和微生物群落相对丰度等多指标由相关软件（Mothur和R）分析而得。

2、结果与讨论

2.1 微生物驯化过程

微生物氢自养驯化过程中Sb（Ⅴ）、Sb（Ⅲ）和TSb的变化情况如图1所示。

由图1（a）可知，在微生物驯化初期，微生物利用H2还原50mg/L的Sb（Ⅴ）至少需要48h，经过3个周期的驯化，锑酸盐还原时间降低至24h。

由图1（b）可知，TSb和Sb（Ⅲ）的变化也随着驯化周期的延长逐渐趋于稳定，TSb的减少量为（4.41±1.07）mg/L。据报道，在还原条件下，Sb主要以可溶性Sb（OH）3的形式存在，因此，TSb浓度的降低可能是因为微生物本身对锑酸盐具有一定的吸附作用。反应完成后，溶液pH从7.5±0.2升高到8.3±0.3，这是因为氢自养还原锑酸盐的过程会消耗H+进而导致pH升高，如式（3）所示。

为进一步探究H2驯化过程中锑酸盐去除速率的变化，考察了驯化周期内的微生物量以及锑酸盐去除速率的变化，结果如表1所示。

由表1可知，经过15个周期的驯化，锑酸盐平均去除速率由0.189mg/（g·h）逐渐稳定在0.472mg/（g·h），表明微生物已具有稳定去除锑酸盐的能力。在整个驯化过程中，生物量呈先降低后升高的趋势，可能是涉及到微生物的选择性生长与富集过程。

2.2 氢自养还原去除水中的锑酸盐

2.2.1 不同温度下氢自养还原锑酸盐动力学

本实验利用H2作为电子供体，开展一系列不同温度条件下锑的生物还原反应，并分别使用零级动力学模型和Michaelis-Menten模型对反应动力学进行拟合，结果如图2所示。

由图2可知，采用零级动力学模型拟合时，不同温度（30、20、10℃）下锑酸盐浓度随时间变化的线性关系不高，表明零级动力学模型不是描述该反应动力学的最佳模型。以H2为电子供体的锑酸盐降解过程更符合Michaelis-Menten模型。

不同温度下氢自养生物还原锑酸盐的动力学参数如表2所示。

由表2可知，用Michaelis-Menten模型拟合时，不同温度（30、20、10℃）下的R2均在0.9以上，表明采用Michaelis-Menten模型描述氢自养还原锑酸盐过程更为适宜。不同温度下拟合得到的qmax为0.040~0.128mg/（g·h），Ks为0.004~0.334mg/L。此外，对不同温度下H2自养还原锑酸盐的热力学进行了分析，基于Michaelis-Menten模型计算得到其活化能为41.88kJ/mol。

2.2.2 不同温度下氢自养还原除锑酸盐效果

不同温度条件下TSb、Sb（Ⅴ）和Sb（Ⅲ）随反应时间的变化如图3所示。

由图3（a）和图3（b）可知，温度为30℃时，经过24h反应，Sb（Ⅴ）被完全去除，TSb去除率为（39.30±0.55）%。同时，Sb（Ⅲ）的浓度随着Sb（Ⅴ）的还原而增加。而当温度下降到20℃时，Sb（Ⅴ）去除率下降到（91.29±0.68）%，TSb去除率为（33.62±0.30）%。当温度进一步降低到10℃时，Sb（Ⅴ）去除率大大下降，仅为（47.30±0.21）%，TSb去除率为（11.61±0.65）%。当温度从30℃降到10℃，Sb（Ⅴ）的去除率下降了52.7%，TSb去除率下降了27.69%。实验结果表明，低温抑制了Sb（Ⅴ）还原菌群的活性，从而导致还原反应进行不彻底。因此，可以得出结论，氢自养还原锑酸盐的适宜反应温度为30℃。

2.2.3 不同温度下出水pH变化

不同温度条件下pH随反应时间的变化情况如图4所示。

由图4可知，随着反应的进行，溶液pH随之升高，这是由于以H2为电子供体时，反应过程中会消耗H+。此外，出水pH与氢自养还原反应的进行程度有着密切关系。当温度为30℃时，由于反应进行的比较彻底，出水pH较高，为9.0±0.04。当温度为20℃时，出水pH为8.9±0.01，当温度进一步降低至10℃时，出水pH为8.8±0.02。

2.2.4 沉淀物表征

对反应器底部固态样品进行了FTIR分析，结果如图5所示。

由图5可知，与接种活性污泥相比，反应后的沉淀产物中出现明显的Sb2O3和Sb（Ⅲ）—O吸收峰。在690、550cm-1处归属于Sb2O3的特征峰，在466cm-1处出现的吸收峰归属于Sb（Ⅲ）—O的伸缩振动。

通过XPS表征分析了接种污泥和反应后污泥样品的表面化学组成，结果如图6所示。

由图6可知，全谱图中可以观察到反应产物中Sb元素的存在。在O1s光谱中，接种污泥和反应后污泥样品在531.2、532.7eV处观察到的两个峰归属于O1s轨道中的C—O和C==O键。反应后污泥样品的Sb3d光谱在Sb3d3/2（539.64eV）和Sb3d5/（2530.3eV）处出现两个峰值，表明了产物中Sb2O（3Sb3+）的存在。因此，FTIR和XPS分析结果证实了反应器内的Sb（Ⅴ）被氢自养还原为Sb（Ⅲ），并进一步吸附到污泥表面生成Sb2O3沉淀物从而进一步去除TSb。

2.2.5 微生物群落多样性分析

微生物样品的有效序列数及α-多样性评价指标如表3所示。

由表3可知，微生物样品的有效序列数为64192~84482，且覆盖范围在0.93以上，表明构建的序列可以覆盖大多数微生物群落。样品的α-多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。H0具有最高的OTUs（6539）、Chao1（25752）、ACE（44121）、Shannon（6.58）和最低的Simpson（0.004）指数，表明原始污泥具有最高的物种丰度和多样性。随着驯化的完成，微生物物种丰度和多样性有明显下降，这一现象与驯化过程中锑酸盐的平均去除速率的变化一致，表明在H2驯化过程中由于Sb（Ⅴ）是唯一的电子受体，一些不参与特定反应的微生物逐渐被竞争淘汰，导致微生物群落的丰度和多样性下降，后期微生物适应了反应条件，生物量逐渐上升，优势菌群进一步增殖，导致微生物丰度的增加。此外，样品T30的Chao1指数最高（2082.0），表明30℃时微生物多样性最为丰富。随着温度的变化，Chao1指数有所变化，表明温度变化影响了微生物多样性。

2.2.6 微生物群落结构分析

通过聚类分析和门水平的微生物群落结构分析来探究驯化过程中不同周期微生物的群落差异，结果如图7所示。

由图7可知，经H2驯化后的微生物与接种微生物具有明显的区别。接种污泥中Proteobacteria（变形菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Chloroflexi（绿弯菌门）为优势菌群，丰度分别为34.58%、19.75%、4.57%和10.11%。在驯化过程中，Proteobacteria的丰度显著增加，为78.50%，表明Proteobacteria是以H2为电子供体还原锑酸盐的优势菌，这与先前的报道一致。值得注意的是，驯化结束后，Firmicutes的丰度增加了2.5倍，表明Fir-micutes也参与了氢自养还原锑酸盐的过程。对于Chloroflexi，驯化结束后其丰度为4.97%，说明Chlo-roflexi可能参与了氢自养还原锑酸盐的过程。而Bacteroidetes的丰度显著降低，表明该细菌可能与氢自养还原锑酸盐无关。因此，在氢自养还原锑酸盐的过程中Proteobacteria为优势菌，Firmicutes为次要微生物，而Chloroflexi可能参与了该过程。在不同温度条件下（T30、T20和T10）的微生物样品中，变形菌门（Proteobacteria）均为主要细菌，丰度始终大于56%，表明氢自养生物还原锑酸盐的优势菌门为Proteobacteria。放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）在反应器中均被检测到，且丰度较高。3个样品（T30、T20和T10）中前5个门相同，但其相对丰度不同，三者相对丰度比例总和分别占比97.9%、97.6%和96.9%。

为进一步分析H2驯化过程中微生物群落的演变，从属水平上对微生物样品进行了比较，结果如图8所示。

由图8可知，接种污泥与H2驯化各阶段微生物在群落结构上存在显著差异。例如，Acinetobacter（γ-Proteobacteria）是驯化过程中最主要的微生物，丰度为34.64%。据报道，Acinetobacter不仅可以有效地还原Cr（Ⅵ）为Cr（Ⅲ），还可以利用H2作为电子供体将Sb（Ⅴ）还原为Sb（Ⅲ）。此外，Comamonas（β-Proteobacteria）和Acetoanaerobium（Firmicutes）的丰度在驯化结束后显著增加。已有研究发现Coma-monas参与了以H2作为电子供体还原锑酸盐的过程。而Acetoanaerobium在氢基营养型生物反硝化群落中富集，因此Acetoanaerobium可能也参与了H2还原锑酸盐的过程。

不同温度下微生物属水平相对丰度如图9所示。

由图9可知，30℃下，优势菌属为Acinetobacter，Chryseobacterium和Hydrogenophaga，其丰度分别为30.7%、18.8%和5.7%。Acinetobacter是γ-Proteobac-teria（γ-变形菌纲）中的一个重要属，其在氢自养锑酸盐还原过程中起着重要作用，可利用H2作为电子供体将Sb（Ⅴ）还原为Sb（Ⅲ）。Chryseobacterium和Hydrogenophaga均属于变形菌门（Proteobacte-ria），有报道指出这些菌属为氢自养反硝化菌属，在本研究中推测其为氢自养还原锑酸盐的优势菌。在20℃条件下，优势菌属为Acinetobacter和Chryseo-bacterium，其丰度分别为39.5%和8.96%，与30℃条件下相比，Chryseobacterium菌属的丰度降低了9.84%。在10℃条件下，Acinetobacter仍是最具优势的菌属，其丰度为34.7%。然而，低温条件下优势菌属Chryseobacterium和Hydrogenophag的丰度均显著降低，这也是低温条件不利于氢自养还原锑酸盐的还原去除的主要原因。

3、结论

1）以H2作为电子供体对活性污泥进行驯化，驯化过程中微生物群落结构发生了较大变化。随着驯化周期的延长，微生物群落的丰度和多样性显著下降。门水平上的优势菌群为Proteobacteria，属水平上的优势菌群为Acinetobacter和Comamonas。

2）不同温度对氢自养还原锑酸盐影响显著。低温不利于氢自养反硝化反应的进行，反应适宜温度为30℃。30℃条件下，Sb（Ⅴ）可在24h内被完全还原为Sb（Ⅲ），TSb去除率为（39.3±0.55）%。

3）FTIR和XPS分析证实了反应体系内的Sb（Ⅴ）被还原为Sb（Ⅲ），并以Sb2O3沉淀物的形式存在。

4）不同温度下微生物细菌的群落结构均发生变化，30℃条件下的优势菌属为Acinetobacter，Chryseo-bacterium和Hydrogenophaga。低温条件下优势菌属Chryseobacterium和Hydrogenophag的丰度均显著降低，不利于氢自养还原反应的进行。